基因的定向進化通過模仿自然選擇的過程，以將基因產生的蛋白功能導向自定義的目標，其過程包括突變的產生、篩選和擴增。相較于體外定向進化技術，基于CRISPR的原位定向進化技術更適用于定向進化多數作物關鍵基因，以達到作物改良的目的。如何創制變異類型更加豐富的飽和突變體文庫是原位定向進化技術的關鍵。近日，萬建民院士團隊開發了新型的多重正交堿基編輯器MoBE和隨機化多sgRNA組裝技術，極大地提升了原位定向進化所需的潛在突變豐度，并獲得了新的抗除草劑水稻突變植株。 　　研究者首先采用RNA配體招募形式的堿基編輯器構象，篩選出高效的腺嘌呤脫氨酶TadA9和胞嘧啶脫氨酶CDA1。利用T2A“自剪切”肽將nCas9 （D10A）切口酶、腺嘌呤堿基編輯模塊（TadA9-N22p）和胞嘧啶堿基編輯模塊（TadA9-N22p）串聯在同一個Ubi-1啟動子后面，構建了多重正交堿基編輯器MoBE。在新開發的嵌合RNA配體作用下，MoBE介導的A>G和C>T雙堿基編輯效率高達73.9%，其中兩種堿基同時編輯的產物平均占比達97%。在三種不同RNA配體形式的作用下，MoBE可以在多位點上分別實現高效的ABE、CBE和A&CBE多重編輯。同時，研究者還開發了MoBE-HF，顯著降低了MoBE的脫靶風險。 　　為實現高通量的飽和編輯sgRNA設計，研究者開發了在線工具PlantBE-CODE （http://pgec.njau.edu.cn/plantbe-code）。以飽和突變OsACC的第34個外顯子為例，利用同尾酶開發了隨機化多sgRNA組裝技術，并通過添加Barcode序列來追蹤靶點和所招募的編輯器信息。在隨機化多sgRNA文庫中，每串聯一個sgRNA表達模塊，不同靶點和不同編輯器的組合類型便會顯著增加。將MoBE和隨機化雙sgRNA文庫相結合，原位定向進化水稻OsACC內源基因。在含1.5倍濃度高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop）的培養基篩選壓力下，獲得了新的抗除草劑的突變體V1703I-W2125C-Hetero、R2126T-G2127A-E2327K/W2125C-E2327K-Biallelic、D1970N/W2125C-Biallelic和I2139N/F2207L-Biallelic等。 　　MoBE和隨機化多sgRNA組裝技術的建立，進一步拓展了基于CRISPR的作物原位定向進化技術體系，為作物基因組編輯新種質創制和挖掘優良等位變異提供了新的工具支撐。該研究成果于2023年08月12日在線發表于植物學知名期刊Plant Biotechnology Journal （doi: 10.1111/pbi.14156）。 　　南京農業大學已畢業碩士生張傲、在讀博士生單調風和孫巖為本文共同第一作者，萬建民院士和李超教授為共同通訊作者。南京農業大學劉裕強教授、吳玉峰教授、董小鷗教授、江玲教授和中國科學院遺傳與發育生物學研究所王延鵬研究員等也參與了部分研究工作。該研究得到農業農村部、江蘇省前沿引領技術基礎研究專項、海南省崖州灣種子實驗室和中國科協等項目資助。 　　原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/pbi.14156