近期，聶堯教授團隊在利用非經典氨基酸理性提高酶蛋白的熱穩定性方面取得重要進展，研究成果“Computational design of noncanonical amino acid-based thioether staples at N/C-terminal domains of multi-modular pullulanase for thermostabilization in enzyme catalysis”正式發表于Computational and Structural Biotechnology Journal （IF=7.271） （https://doi.org/10.1016/j.csbj.2020.12.043）。   　　酶的熱穩定性是酶蛋白的一個重要特性，其可用于評估酶蛋白在工業應用的可行性，故酶蛋白的熱穩定化被認為是生物合成中一個關鍵且通常必須的步驟。酶蛋白熱穩定化的常規策略通常是引入由天然氨基酸取代引起的非共價相互作用和/或天然共價鍵來穩定酶蛋白。然而，酶蛋白尤其是多結構域蛋白的活性與穩定性之間的權衡仍然是一個挑戰。   　　該研究拓展了一種計算機輔助策略，通過將非經典氨基酸引入形成硫醚鍵來“裝訂”具有多結構域的普魯蘭酶（BtPul）相對柔性的N/C端結構域，以提高其熱穩定性。首先利用RosettaMatch算法及自由能預測工具設計并優化溴乙基-酪氨酸在普魯蘭酶N/C末端結構域中的引入位點；其次，采用雙質粒共表達的方式在宿主菌中引入目的基因重組質粒的同時引入O2beY正交氨酰-tRNA合成酶/tRNA系統，從而使O2beY能夠翻譯至目的蛋白中；最終，通過誘導表達實現非天然硫醚鍵對普魯蘭酶N/C端結構域的“裝訂”。多個單突變體酶學性質的研究結果顯示，最優突變體T73（O2beY）-171C的半衰期較野生型提高157％，Tm值提高7.0 ℃。通過進一步引入親水性殘基增加非天然硫醚鍵周圍疏水表面上的局部親水性以實現酶的活性-穩定性的平衡，組合突變體T73（O2beY）-171C/T126F/A72R在70 ℃下的半衰期提高211％，酶活增加44％。該研究通過計算機輔助設計非天然共價硫醚鍵“裝訂”酶蛋白的方式擴展了酶熱穩定改造策略，為其它酶蛋白尤其是多結構域酶的穩定性改造提供了參考。   　　聶堯教授為論文通訊作者，生物工程學院碩士研究生畢家華為第一作者。上述研究工作得到了國家自然科學基金項目（31872891）、高端外國專家項目（G20190010083）、江蘇省六大人才高峰項目（2015-NY-007）、宿遷市酶學重點實驗室項目（M201803）、輕工技術與工程一流學科建設項目（LITE2018-09）等的資助。