近日，Nucleic Acids Research在線發表了江南大學未來食品科學中心和生物工程學院陳堅院士團隊劉龍教授課題組的研究成果“A pathway independent multi-modular ordered control system based on thermosensors and CRISPRi improves bioproduction in Bacillus subtilis”（Yu et al., Nucleic Acids Research. 2022. 50, 11: 6587-6600）。江南大學2019級博士生于文文為論文第一作者，劉龍教授為論文通訊作者。   　　合成生物學與代謝工程的一個主要目標是構建微生物細胞工廠進行化學品的高效生產，其關鍵是如何實現微生物代謝網絡代謝流的最優分配。基因回路可以有效平衡細胞生長與產物合成模塊的代謝流競爭，緩解胞內代謝壓力。然而目前大部分基因回路只能同時激活/抑制靶向模塊，無法實現多個代謝模塊的獨立、正交和時序調控。此外，大多數胞內代謝物缺乏與之對應的生物傳感器，這極大限制了基因回路的普適性。   　　為解決上述難題，該研究在模式工業微生物枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中創制了溫敏型多模塊時序雙向調控系統，并將其應用于2'-巖藻糖基乳糖（2'-FL）的代謝網絡優化。首先，利用大腸桿菌噬菌體中溫敏型轉錄因子突變體CI857的調控機制，設計并創制了多個不同激活點（30、32、34與37℃）的溫敏型生物傳感器。其次，將多個不同激活點的溫敏型生物傳感器進行聯用，構建了一種可以對多代謝模塊進行時序激活調控的單輸入多輸出（SIMO）基因回路，并對該基因回路的正交性與功能性進行了驗證。隨后，將溫敏型生物傳感器與基于CRISPRi的邏輯“非”門進行耦合，構建了一種可以對不同代謝模塊進行激活與抑制的雙功能基因回路，并對該基因回路進行了功能驗證。   　　在上述研究基礎上，在B. subtilis內重構了2'-FL代謝途徑，并將其分為3個模塊：2'-FL合成模塊、GTP供給模塊、競爭途徑模塊。利用激活點為34℃的溫敏型生物傳感器構建激活回路并應用至2'-FL合成模塊，通過對不同靶點基因的組合優化控制，2'-FL的搖瓶產量提高至755.0 mg/L；利用激活點為37℃的溫敏型生物傳感器，構建抑制回路動態下調糖酵解途徑與磷酸戊糖途徑，實現了2'-FL合成模塊與競爭模塊解偶聯時序調控。通過組裝不同強度的抑制位點，實現了代謝流的最優調控，2'-FL的產量達到1399.5 mg/L。在此基礎上，利用激活點為34℃的溫敏型生物傳感器，將GTP供給模塊與2'-FL合成模塊偶聯激活，2'-FL的產量進一步提高至1839.7 mg/L。最后，在5-L發酵罐上對該調控系統的穩定性與魯棒性進行了驗證，2'-FL的產量達到了28.2 g/L。   　　上述研究工作得到了國家重點研發項目（2021YFD2100700）、國家自然科學基金（31930085, 32021005）、中央高校基本科研專項資金（JUSRP52019A, JUSRP121010, JUSRP221013）等項目的資助。