近期，江南大學生物工程學院陳獻忠教授團隊在熊蜂生假絲酵基因編輯技術方面取得重要進展，研究成果“A CRISPR–Cas9 system mediated genetic disruption and multi-fragment assembly inStarmerella bombicola”正式發表于ACS Synthetic Biology（IF=5.11, 2022） （DOI: 10.1021/acssynbio.1c00582）。   　　槐糖脂作為一種生物表面活性劑，因其具有乳化性、增溶性、抑菌性及生物可降解表面活性等特性，近年來展現出相當廣闊的市場應用前景。熊蜂生假絲酵母（Starmerella bombicola）作為槐糖脂生產菌株之一，可以在以油酸和葡萄糖為共同碳源的條件下生產槐糖脂。然而，該菌株作為一種非常規假絲酵母，其遺傳背景并不清晰，且表達系統不夠完善，同時常規的基因改造手段效率低。因此在很大程度上限制了該菌株的代謝工程改造。   　　陳獻忠教授團隊針對上述問題，以酵母增強型綠色熒光蛋白（yEGFP）為報告基因，篩選熊蜂生假絲酵母啟動子表達元件，獲得了系列轉錄強度不同的啟動子。在此基礎上，將來源于釀膿桿菌的Cas9基因進行密碼子優化，在強啟動子PTEF1驅動下構建了整合表達型CRISPR-Cas9編輯系統。通過設計并結合不同強度啟動子及sgRNA表達元件對該系統進行優化，最終在大大提高陽性轉化子數量的同時，使得單基因及雙基因編輯效率達到100%，并實現了三基因的同時編輯（16.5%）。該團隊也對瞬時表達系統進行了評價，發現瞬時表達的CRISPR-Cas9系統在單基因編輯時也可以達到100%的編輯效率。此外，在CRSIPR-Cas9系統的介導下，通過體內一步多片段組裝技術，在敲除內酯化酶SBLE和過氧化物酶體膜轉運蛋白PXA1基因的基礎上，進一步利用強組成型啟動子PTEF1及PENO，上調槐糖脂合成關鍵基因CYP52M1及CPR的表達，最終得到了單一生產酸型槐糖脂高產重組菌株，其酸型槐糖脂的產量可以達到99.5 g/L，相比于野生型菌株提高了5.5倍。本研究為該菌株在代謝工程改造方面提供了高效的編輯工具，同時也為槐糖脂的進一步應用奠定了基礎。   　　陳獻忠教授為上述系列論文的通訊作者，我校2021級博士生石依博為第一作者。上述研究得到了國防科技項目（18-163-12-ZT-003-014）和江蘇省自然科學基金（BK20171138）等項目資助   　　近年來陳獻忠教授團隊以具有重要工業應用潛力的非常規酵母為底盤細胞，開發了系列高效的基因編輯技術和代謝調控方法（Biotechnology and Bioengineering, 2020；Microbiology Spectrum，2022），并通過系統代謝工程構建了高效生產萜類天然產物的酵母細胞工廠（Biotechnology for Biofuels and Bioproducts, 2022）。